Helicobacter hepaticus colonization in mice: newborn tolerance properties and distribution throughout the gut

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Diferentes estudos desenvolvidos pelo nosso grupo envolveram colonização com Helicobacter hepaticus (Hh) reproduzindo um tipo de interação hospedeiro-microorganismo. Dados anteriores aos que são apresentados neste projeto reportaram que após a colonização com Hh em ratos adultos saudáveis B6 WT é desencadeada uma resposta robusta de imunoglobulina (Ig) específica contra Hh, acompanhada por uma redução da densidade bacteriana (dados não pulicados). Também foi observado que é necessária uma resposta de células B dependente de células T para controlar a densidade de Hh e que a citoquina responsável pela persistência de Hh, IL-10, é essencial para modular esta resposta. Curiosamente, aquando da colonização com esta bactéria em ratos neonatos B6 WT, a resposta de Igs específicas não se verificou e estes animais apresentaram densidades elevadas de Hh. Por fim, a tolerância a Hh – mediada por IL-10 e sustentada por células T regulatórias CD25+ – foi mantida mesmo quando os animais atingiram a idade adulta (dados não publicados). Tendo em conta as evidências referidas acima, o grande foco deste trabalho residiu no contraste entre a colonização com Hh no período neonatal e no adulto. Neste contexto, decidimos explorar o papel da presença de uma microbiota complexa na resposta de tolerância a Hh. Assim, a partir de animais GF (desprovidos de qualquer microorganismo) B6 foram produzidos animais Ad.mcol – colonização ig com Hh de cultura em ratos com 8 semanas e analisados 9 semanas pós-colonização – e animais Nb.mcol – nascidos a partir de mães mono-colonizadas com Hh e analisados com 9 semanas de idade. Semelhante ao que tinha sido demonstrado para animais SPF Nb.col (dados não publicados), não foi detetada IgA anti-Hh nas fezes de ratos Nb.mcol provando que a tolerância a Hh é independente da microbiota. Para além disso, demonstrámos que a Ig específica contra Hh se liga diretamente à sua superfície. Isto foi inferido através da incubação de extratos fecais de ratos Ad.col e Nb.col, usando como controlo negativo animais SPF, com Hh crescida em cultura. Posteriormente, a análise por citometria de fluxo confirmou que o anticorpo produzido especificamente contra Hh se liga efetivamente à sua superfície, o que ainda não tinha sido demonstrado até ao momento. A concentração de IgA detetada através de ELISA envolve a incubação de amostras de fezes com um lisado de Hh, sendo apenas determinada a IgA específica que a reconhece e se liga aos seus antigénios. Pelo contrário, uma vez que incubámos amostras de fezes com uma suspensão de Hh crescida em cultura no ensaio descrito acima, a integridade estrutural da parede celular bacteriana não foi comprometida. Assim, foi possível replicar a interação entre o sistema imunitário do hospedeiro e as bactérias num contexto in vivo, sendo considerado como um modelo plausível do que acontece ao nível fisiológico quando a IgA encontra estas bactérias intactas dentro do hospedeiro: a IgA reconhece os antigénios que se encontram na superfície de Hh presente no lúmen do intestino e a sua afinidade promove uma ligação específica; estes microorganismos ficam revestidos com IgA e impedidos de atravessar a barreira intestinal, mecanismo que ainda não é claro. Neste trabalho, também foram identificados os nichos intestinais ocupados por esta bactéria determinando a densidade de Hh em animais Rag2-/- (imunodeficentes), Ad.col e Nb.col. Os nossos dados após a análise da densidade de Hh por qPCR mostraram que a Hh está presente em maior densidade no caecum (em geral, 104 cópias de 16S de Hh por 16S total), de seguida no íleo e cólon (Rag2-/- = ~102 cópias de 16S de Hh/16S total; B6 Ad.col = ~1 cópia de 16S de Hh/16S total; B6 Nb.col = ~101-102 cópias de 16S de Hh/16S total) e em menor número no jejuno (Rag2-/- Ad.col e B6 Nb.col = ~10 cópias de 16S de Hh/16S total; B6 Ad.col < 1 cópia de 16S de Hh/16S total). Os animais Rag2-/- Ad.col exibiram ainda uma elevada densidade de Hh no recto comparativamente aos outros grupos (104 cópias de 16S de Hh/16S total). O facto de Hh ter sido isolada originalmente a partir do cólon e também do fígado de ratos com hepatite crónica ativa, tumores hepáticos e IBD, motivou a investigação da sua capacidade de atravessar a barreira epitelial intestinal sob as nossas condições experimentais. Dados obtidos anteriormente no nosso grupo sugeriram que Hh é capaz de atravessar o epitélio intestinal em ratos B6 Ad.col, indicado pela presença de IgM (primeira Ig a ser produzida por células B maduras) e IgG (produzido mediante hipermutação somática após estimulação) específicos para Hh no seu soro. Por outro lado, tínhamos evidências de que a densidade de Hh nas fezes em ratos Rag2-/- Ad.col desprovidos de células B e T maduras (mutantes em que a função da enzima que participa na recombinação V(D)J está comprometida, tanto no locus de Ig como no receptor das células T) é maior do que em ratos B6 Ad.col. Assim, averiguámos se 1) a ausência do sistema imunitário adaptativo e 2) o período de colonização, alteram o tráfico de Hh para fora do epitélio intestinal. Para perceber se esta bactéria tem a capacidade de atravessar o epitélio nestas condições experimentais – em animais Rag2-/- Ad.col, B6 Ad.col e B6 Nb.col – a densidade de Hh em vários órgãos internos analisada por qPCR. A capacidade de Hh atravessar a barreira intestinal permaneceu indeterminada; embora tenha sido verificado um maior número de Hh nos MLN de ratos Rag2-/- Ad.col relativamente aos outros grupos, esta bactéria não foi detetada no fígado e baço em nenhum dos grupos analisados. Por outro lado, foram detetadas aproximadamente 10 cópias de 16S de Hh por ng de DNA do hospedeiro na GB de ratos B6 Nb.col, mas não em Rag2-/- ou B6 Ad.col. A cultura de Hh a partir dos diferentes órgãos internos referidos revelou-se necessária para confirmar ou esclarecer estes resultados. Finalmente, decidimos comparar o perfil inflamatório destes dois grupos numa situação de disrupção da barreira intestinal. Também investigámos se a colonização com Hh promove a progressão da resposta inflamatória no intestino, comparando estes grupos com animais SPF. Assim, o efeito da colonização com Hh numa situação de patologia intestinal foi analisado. Para replicar esta situação foi utilizado um modelo de colite induzida por DSS, avaliando a severidade da inflamação pela perda de peso corporal e pelos níveis de Lcn-2 nas fezes (ELISA) dos animais analisados (n=5 por grupo). Globalmente, uma relativa reprodutibilidade foi verificada entre as duas experiências realizadas independentemente. Como esperado, foi observada uma diminuição gradual do peso a partir do 4º dia do tratamento com DSS em ambas as experiências. No geral, a colonização com Hh não afetou o peso dos animais analisados até ao dia 9 (1 dia após ter sido removido DSS). Na primeira experiência, foi observada uma perda de peso constante até ao 11º dia em todos os grupos; porém, posteriormente, houve uma grande variação entre os ratos B6 Nb.col provocada por 2 animais, que apresentaram uma perda de peso mais drástica. Ainda assim, todos os animais voltaram a ganhar peso sensivelmente a partir dos 12º-13º dias, após o DSS ter sido removido, acabando por recuperar o peso inicial. Na segunda experiência, também foram detectadas algumas diferenças posteriormente ao 10º dia, embora num menor número de dias. Contudo, os níveis fecais de Lcn-2 não se correlacionaram com o do peso corporal: níveis elevados de Lcn-2 vs recuperação do peso inicial. A regeneração da mucosa intestinal bem como a manutenção da tolerância a Hh serão alvo de estudos futuros.Helicobacter hepaticus (Hh)-newborn colonization in B6 WT mice generates a tolerant response characterized by: undetectable faecal and serum Hh-specific IgA, high bacterial loads and maintenance of tolerance until adult life. In this study, monocolonization with this pathobiont revealed that this response is microbiota-independent. Moreover, we demonstrated that the specific Ig produced against Hh binds specifically to its surface. The niches inhabited by this microbe within the mouse GI tract were identified: higher Hh loads were found in the caecum followed by colon and ileum and, at lower number, in jejunum. In immunodeficient mice a high Hh load was found within the rectum. Hh ability to traverse the intestinal epithelial barrier remained uncertain as our data was unclear in this respect. Although a higher Hh load was estimated within MLN from immunodeficient Ad.col mice, it was not detected within the liver and spleen from any of the groups analysed. Still, we estimated around 10 copies of Hh 16S per ng of host DNA only within the GB from B6 Nb.col mice. Culture of Hh from the various internal organs is required to confirm these results. Finally, we investigated the effect of Hh colonization in the context of intestinal pathology. DSS-induced colitis was used to model intestinal disease, evaluating the severity of the inflammation. Generally, Hh colonization did not affect animal weight; however, the levels of faecal Lcn-2 did not correlate with body weight in both experiments: high Lcn-2 levels vs recovery of the initial weight. Mucosal healing and maintenance of tolerance to Hh will be subject for further work

Development of an ethologically relevant chronic stress model of depression

Tese de mestrado, (Biologia) Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010It is known that the application of a 4-week chronic stress in C57BL/6 mice leads to the development of anhedonia, a core symptom of depression, assessed by the decrease in sucrose intake and preference. The chronic stress paradigm also leads to locomotor changes, anxietylike behavior and impairment in memory and learning. The aim of this project was to study the effects of the application of a shorter chronic stress (2 weeks), consisting only of ethological stressors on hedonic status, anxiety-like behavior, locomotion and hippocampus-dependent performance, in C57BL/6 mice. In study 1, animals’ daily water drinking patterns were evaluated in order to optimize a sucrose test. In study 2, mice were divided into control and stress groups, based on baseline body weight, sucrose test data and social status. Mice from stress group were then submitted to chronic stress, consisting of rat exposure over-night and social defeat using CD1 male mice. After the chronic stress procedure, body weight, hedonic status in the sucrose test, anxiety-like behavior in the elevated O-maze test, open-field activity at different times of the day cycle, and hippocampus-dependent performance in the food-displacement tube test and in the contextual fear-conditioning paradigm, were assessed. Mice showed, in study 1, a large variability in patterns of water consumption, suggesting the application of a sucrose test of longer duration. In study 2, stressed mice showed no significant decrease in sucrose preference, but they presented an increased water intake, which is regarded as a sign of stress. They also showed significant reduction in weight, compared to control mice, and significant anxiolytic-like changes both in O-maze and openfield tests. In addition, stressed mice spent less time freezing in the fear conditioning paradigm than control mice, showing impairment in hippocampus-dependent performance. We did not see significant differences between groups in the food-displacement tube test, however a positive correlation was found between freezing behavior and number of pellets taken from the tube. Together, our data suggests that applied here 2-week ethological stress induced a depressive-like phenotype and had signs of physiological impact in C57BL/6. However, more studies are required to validate this model.A depressão é uma doença grave, que provoca risco de vida. De acordo com a Associacao Psiquiatrica Americana (Manual Estatistico e de Diagnóstico de Doenças Mentais, DSM-IV, 1994), uma pessoa diagnosticada com depressão deve apresentar, juntamente com humor disfórico e perda de interesse ou prazer em quase todas as actividades, ou seja anedonia, pelo menos 4 sintomas adicionais, entre os quais agitação ou retardo psicomotor, perda marcada de peso, perturbações de sono, diminuição de apetite, sentimentos de culpa ou ideação suicida, durante um periodo de pelo menos 2 semanas. Vários modelos animais são usados, usando roedores, para mimetizar esta doença, os quais se baseiam na aplicação de stressores aos animais, de modo a induzir caracteristicas tipicas de depressão e, assim, possibilitar o estudo em laboratorio desta sindrome. Estudos prévios mostram que a aplicação de stress crónico durante longos periodos de tempo induz, em murganhos C57BL/6, uma sindrome típica de depressão e anedonia, um sintoma chave da depressão, avaliado pela diminuição no consumo e preferência por uma solução de sucrose. Este paradigma conduz, ainda, a alterações na locomoção, no comportamento típico de ansiedade e a danos na memória e aprendizagem. No entanto, por motivos éticos, esforços têm sido efectuados no sentido de diminuir a carga de stress e desconforto em animais de laboratorio. O objectivo deste projecto foi, então, estudar os efeitos da aplicação de um stress crónico de menor duração (2 semanas), limitando-nos à utilização de stressores etológicos (naturais), no estado hedónico, comportamento tipico de ansiedade, locomoção e desempenho dependente do hipocampo, em murganhos C57BL/6. O estudo 1 consistiu na avaliação dos padrões diários de consumo de água de 23 animais durante 3 dias consecutivos, de modo a optimizar o teste de sucrose. Foram analisados tanto os seus valores totais de consumo de água, como os picos diários no consumo. No estudo 2, 32 murganhos C57BL/6 foram divididos em 2 grupos, controlo (n = 10) e stress (n = 22), usando como parâmetros o seu peso corporal base, os dados de um teste de sucrose (preferência pela solução de sucrose, consumo de água e de sucrose, e consumo total de liquidos) e o seu status social (agressivo, submisso ou neutro). Os animais do grupo stress foram, posteriormente, submetidos ao procedimento de stress crónico, durante 2 semanas, que consistiu na exposição a ratos durante a fase nocturna do seu ciclo diario, e derrota social, com exposição a murganhos machos CD1, duas vezes por dia. Relativamente ao estudo 1, verificou-se que a quantidade de líquido consumida variou significativamente ao longo dos 3 dias de teste. O volume de água consumido decresceu do dia 1 para o dia 2, e deste para o dia 3. Este decréscimo pode ser explicado por dois motivos: flutuações na temperatura, visto que ocorre uma diminuição no consumo de água quando a temperatura diminui, ou preferência dos animais por água fresca. Verificou-se, ainda, a existencia de 4 picos de consumo em murganhos C57BL/6: +2,5h, +5h, +7,5h e +10h, apos o inicio do teste. Os animais, em geral, não mantêm o mesmo pico no consumo de dia para dia. Estes dados evidenciam uma grande variabilidade na dinâmica diária de consumo de líquidos nestes animais, ressalvando a importância da utilização de testes de maior duração, quando se pretendam avaliar consumo de líquidos. Assim, escolhemos aplicar os testes de sucrose durante 24h, de modo a evitar o uso de protocolos de duração menor que podem ser erróneos. Quanto ao estudo 2, apos exposição a stress cronico, os seguintes parâmetros foram avaliados nos murganhos: peso corporal, estado hedónico no teste de sucrose, comportamento típico de ansiedade no teste 0-maze elevado, actividade em open-field a diferentes alturas do ciclo diário, e desempenho dependente do hipocampo no teste de deslocamento de comida de um tubo e no paradigma de condicionamento de medo contextual. Após a aplicação de stress crónico, embora tenhamos visto sinais de stress pelo aumento no consumo de água nos animais submetidos ao mesmo, ambos os grupos de animais não demonstraram uma preferência por sucrose em vez de água. Estes resultados demonstram a presenca de resultados anormais neste parâmetro no grupo controlo. Este comportamento anormal pode dever-se a falhas no teste de sucrose e não no procedimento de stress em si. Por razões técnicas, não nos foi possivel repetir este teste, o que nos deixa na incógnita quanto ao desenvolvimento ou não de anedonia. Contudo, tudo isto sugere que o nosso procedimento de curta duração e intensidade não conduziu a mudancas detectaveis no estado anedónico dos murganhos. A indução de anedonia pode, assim, necessitar de uma determinada carga de stress, que não foi alcancada com este modelo. Observou-se, ainda, um efeito do stress no peso corporal, sendo que os murganhos submetidos a stress sofreram uma redução significativa no peso corporal, quando comparados com os murganhos controlo. Relativamente ao teste de 0-maze, os murganhos stressados demoraram menos tempo a sair das areas fechadas do aparelho para as areas associadas a ansiedade, ou seja, abertas ao exterior. Despenderam, ainda, mais tempo nessas areas e sairam mais vezes para as mesmas, que os animais controlo. Estes comportamentos são comportamentos típicos ansiolíticos, ou seja, os animais não demonstraram sinais de ansiedade. Tais resultados podem ser devidos ao desenvolvimento de hiperactividade, uma caracteristica de murganhos C57BL/6 submetidos a stress. Esta hiperactividade pode ser causada tanto pela intensidade e duração do stress crónico como pela utilização de luz forte (25-Lux). Os resultados obtidos no teste de openfield corroboram os resultados obtidos no teste 0-maze. Neste teste observamos, tambem, sinais de hiperactividade quando realizado sob luz forte, sendo que os animais passaram menos tempo imóveis no total, e tanto na zona periférica como na zona central do aparelho, outro sinal de comportamento típico ansiolítico. No teste realizado sob luz vermelha, os animais não mostraram alterações na locomoção. Neste estudo, observamos que os animais stressados despenderam significativamente menos tempo estaticos no teste de condicionamento de medo contextual e mostraram uma tendencia para um aumento do tempo de latencia no comportamento de deslocamento e um número reduzido de pellets retirados do tubo, 1h apos o inicio do teste de deslocamento de comida de um tubo, quando comparados com o grupo controlo. Assim, esta parte do nosso estudo sugere a existência de danos na função do hipocampo, apos 2 semanas de stress. Este estudo revelou ainda, pela primeira vez, uma correlação positiva entre estes dois testes, mostrando que o teste de deslocamento de comida de um tubo pode ser um teste válido para a detecção de défices na função do hipocampo. Em conjunto, os nossos dados deixam em aberto a possibilidade de que o nosso modelo de stress crónico pode ter induzido anedonia, apenas não o conseguimos detectar com o nosso teste de sucrose. Os resultados obtidos acerca da plasticidade do hipocampo e as alterações observadas no teste do 0-maze e no peso corporal corroboram esta conclusao. Sugerimos que o nosso protocolo de stress induziu um fenotipo típico de depressão em murganhos C57BL/6. No entanto, mais estudos serão necessarios para validar este modelo

Interculturally effetive people within organizational wide agility anda science fition as testing ground. Star Trek Voyager as case study

Versão Final (Esta versão contém as críticas e sugestões dos elementos do jurí)O trabalho que se apresenta procura estabelecer relação entre o que é preconizado como uma Pessoa interculturalmente eficaz e como isso pode ser potenciado no âmbito dos negócios. Para esse fim, o Capítulo I introduz termos relacionados com eficácia intercultural e expressa as razões por que há uma necessidade crescente de pessoas cientes da eficácia intercultural. Em seguida, no Capítulo II, algumas ferramentas relacionadas com agilidade e seus respetivos valores utilizados nos negócios são apresentados, e que são Agile, Sociocracy, Beyond Budgeting e Open Space, bem como uma teoria sincrética - BOSSA - que juntos podem apoiar a prestação de Pessoas interculturalmente eficazes num ambiente de negócios. Para terminar, no Capítulo III a Ficção Científica é trazida à colação como possível campo de teste para a eficácia da agilidade em potenciar a interculturalidade nos negócios. Aqui a Star Trek Voyager é apresentada como um possível ambiente movido pela agilidade.The work presented tries to establish a connection between what is professed as an Interculturally Effective Person and how it can be strengthened within business. To that end, Chapter I introduces terms related to intercultural effectiveness and expresses the reasons why there is a growing need for people to be aware of intercultural effectiveness. Then, in Chapter II, a few agility related frameworks and their respective values used in business are presented, which are Agile, Sociocracy, Beyond Budgeting and Open Space, as well as a syncretic theory - BOSSA - that together may support the provision for Interculturally Effective People in a business environment. To end, in Chapter III Science Fiction is brought to the fore as possible testing ground for the effectiveness of agility in potentiating interculturality in business. Here Star Trek Voyager is presented as a possible agility driven environment

Reading comprehension in primary school: textbooks, curriculum and assessment

This study describes the reading comprehension processes present in the most widely sold textbooks at the fourth grade level in Portugal and discusses how they compare to international assessments of reading literacy. We adopted the Progress of International Reading Literacy Study framework to categorize the questions in the textbooks. Our analyses revealed that they focus heavily on the retrieval of explicitly stated information to the detriment of higher level comprehension skills. Portuguese fourth grade textbooks rarely challenge students to make connections between their knowledge and the ideas in the texts and to adopt a critical and evaluative reading stance. This is in sharp contrast to what students are asked to do in the Progress of International Reading Literacy Study, conducted every five years since 2001, and it may help explain the poor results Portuguese students have in national assessment and in PISA. The findings are discussed in light of the curriculum frameworks currently adopted in Portugal and suggestions are made as to how we can improve reading literacy achievement

The impact of talent management practices on employee retention: The moderator effect of leader-member exchange and role modeling

Organizations are undergoing serious difficulties to retain talent. Authors argue that Talent Management (TM) practices create beneficial outcomes for individuals and organizations. However, there is no research on the leaders’ role in the functioning of these practices. This study examines how LMX and role modeling influence the impact that TM practices have on employees’ trust in their organizations and retention. The analysis of two questionnaires (Nt1=175; Nt2=107) indicated that TM only reduced turnover intentions, via an increase in trust in the organization, when role modeling was high and not when it was low. Therefore, we can say that leaders are crucial in the TM context, and in sustaining a competitive advantage for organizations